Форетиниб (GSK1363089)

Молекулярный вес: 632,65. Форетиниб (GSK1363089) является АТФ-конкурентным ингибитором HGFR и VEGFR, в основном для Met и KDR с IC50 0,4 нМ и 0,9 нМ. Менее эффективен против Ron, Flt-1/3/4, Kit, PDGFRα / β и Tie-2 и имеет низкую активность в отношении FGFR1 и EGFR. Фаза 2. \ n Биологическая активность XL880 ингибирует тирозинкиназы семейства рецепторов HGF со значениями IC50 0,4 нМ для Met и 3 нМ для Ron. XL880 также ингибирует KDR, Flt-1 и Flt-4 со значениями IC50 0,9, 6,8 и 2,8 нМ соответственно. XL880 подавляет рост колоний клеток B16F10, A549 и HT29 с IC50 40 нМ, 29 нМ и 165 нМ соответственно. Недавнее исследование показывает, что XL880 по-разному влияет на рост клеток в клеточных линиях рака желудка MKN-45 и KATO-III. XL880 ингибирует фосфорилирование MET и нижестоящих сигнальных молекул в клетках MKN-45, в то время как нацелен на GFGR2 в клетках KATO-III. Разовая доза XL880 через желудочный зонд 100 мг / кг приводит к значительному ингибированию фосфорилирования Met опухоли B16F10 и индуцированного лигандом (например, HGFor VEGF) фосфорилирования Met рецепторами в печени и Flk-1 / KDR в легких, которые оба сохраняются через 24 часа. \ n Лечение XL880 (30–100 мг / кг, один раз в день, через желудочный зонд) приводит к снижению опухолевой нагрузки. Распространенность опухолей на поверхности легких снижается на 50% и 58% после лечения 30 и 100 мг / кг XL880 соответственно. Обработка XL880 мышей с солидными опухолями B16F10 также приводит к дозозависимому ингибированию роста опухоли на 64% и 87% при дозах 30 и 100 мг / кг соответственно. \ n В обоих исследованиях введение XL880 хорошо переносится без значительной потери веса. XL880 разработан для нацеливания на аномальную передачу сигналов HGF через Met и одновременно нацеливания на несколько рецепторов тирозинкиназы, участвующих в ангиогенезе опухоли. XL880 вызывал кровоизлияние и некроз опухоли в ксенотрансплантатах человека в течение 2-4 часов, а максимальный некроз опухоли наблюдается через 96 часов (после пяти ежедневных доз), что приводит к полной регрессии. \ n Анализ ингибирования киназы Ингибирование киназы исследуют с использованием одного из трех форматов анализа: перенос [33P] фосфорила, хемилюминесценция, связанная с люциферазой, или технология тирозинкиназ AlphaScreen. IC50 рассчитывают с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием XLFit.33P-анализа киназы переноса фосфорила. Реакции проводят в 384-луночных белых микротитровальных планшетах с прозрачным дном и высоким связыванием (Greiner, Monroe, NC). \ n Планшеты покрывают 2 мкг / лунку белкового или пептидного субстрата в объеме 50 мкл буфера для покрытия, содержащего 40 мкг / мл субстрата (поли (Glu, Tyr) 4: 1, 22,5 мМ Na2CO3, 27,5 мМ NaHCO3, 50 мМ NaCl и 3 мМ NaN 3. Покрытые планшеты промывают один раз 50 мкл буфера для анализа после инкубации в течение ночи при комнатной температуре (RT). Тестируемые соединения и ферменты объединяют с 33P-γ-ATP (3,3 мкКи / нмоль) в общем объеме. 20 мкл. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов и останавливают аспирацией. \ n После этого планшеты для микротитрования промывают 6 раз 0,05% буфером Tween-PBS (PBST). Добавляют сцинтилляционную жидкость (50 мкл / лунку). и включенный 33P измеряют с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрометрии с использованием сцинтилляционного счетчика MicroBeta. Хемилюминесцентный анализ, связанный с люциферазой. Реакции проводят в 384-луночных белых микротитровальных планшетах со средним связыванием (Greiner). \ n На первом этапе фермент и соединение объединяют и инкубируют в течение 60 минут; реакции инициируются добавлением АТФ и пептидного субстрата (поли (Glu, Tyr) 4: 1) в конечном объеме 20 мкл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-4 часов. После киназной реакции добавляют аликвоту киназы Glo (Promega, Madison, WI) объемом 20 мкл и измеряют сигнал люминесценции с помощью планшет-ридера Victor. Общее потребление АТФ ограничено 50%. \ n Используются донорские гранулы для анализа тирозинкиназы AlphaScreenTM, покрытые стрептавидином, и акцепторные гранулы, покрытые антифосфотирозиновым антителом PY100. В качестве субстрата используется биотинилированный поли (Glu, Tyr) 4: 1. Фосфорилирование субстрата измеряется добавлением донорно-акцепторных гранул по люминесценции после образования комплекса донорно-акцепторных гранул. Киназу и тестируемые соединения объединяют и предварительно инкубируют в течение 60 минут с последующим добавлением АТФ и биотинилированного поли (Glu, Tyr) в общем объеме 20 мкл в 384-луночных белых микротитровальных планшетах со средним связыванием (Greiner). Реакционные смеси инкубируют 1 час при комнатной температуре. \ n Реакции гасят добавлением 10 мкл 15-30 мкг / мл суспензии шариков AlphaScreen, содержащей 75 мМ Hepes, pH 7,4, 300 мМ NaCl, 120 мМ EDTA, 0,3% BSA и 0,03% Tween-20. После 2-16 часов инкубации при комнатной температуре планшеты считывают с помощью ридера AlphaQuest. Метод \ n Клетки B16F10, A549 и HT29 (1,2 × 103 на лунку) смешивают с мягким агаром и высевают в 96-луночный планшет, содержащий 10% FBS и EXEL-2880, поверх основного слоя агара. Для нормоксических условий чашки инкубируют (37 ° C) в течение 12-14 дней в 21% кислорода, 5% CO2 и 74% азота, тогда как инкубацию (37 ° C) в условиях гипоксии проводят в камере для гипоксии в 1 % кислорода, 5% CO2 и 94% азота. Количество колоний оценивают в каждом состоянии после добавления 50% аламарового синего и детектирования флуоресценции. \ п

Группа Продуктов : Протеин тирозинкиназа > Ингибитор PDGFR